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LED光源-從顯微成像到光遺傳學(xué)研究
koster / 2019-08-13

生物學(xué)研究中的LED：

從顯微成像到光遺傳學(xué)

由于LED被引入生物科學(xué)研究的顯微鏡照明，使研究小組和影像實(shí)驗(yàn)室有信心將其范圍和潛力完全取代金屬鹵化物光源，合適的HBO弧光燈替代品一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。但隨著最近推出的全光譜照明裝置和更先進(jìn)的系統(tǒng)，LED照明正在成為新的標(biāo)準(zhǔn)。

顯微鏡長(zhǎng)期以來(lái)一直在生物科學(xué)研究中占據(jù)重要位置，可追溯到第一次觀察
活細(xì)胞包括使用LED的技術(shù)已經(jīng)開發(fā) - 并且將繼續(xù) - 以滿足研究人員新的和不斷變化的需求。

生物科學(xué)顯微鏡
生物科學(xué)微拷貝中使用的技術(shù)可分為兩個(gè)主要陣營(yíng)：

透射光，明視場(chǎng)顯微鏡，用于可視化染色的組織學(xué)樣本或采用對(duì)比度方法，如相位對(duì)比度，微分干涉對(duì)比度和浮雕對(duì)比度;
反射光熒光顯微鏡

圖1a，1b。明場(chǎng)顯微鏡圖像描繪了染色載玻片（a）和遷移室（b）中細(xì)胞的相襯圖像。
為了篩選染色組織（圖1a）或?qū)Ρ燃夹g(shù)，如相（圖1b）或DIC，典型的研究實(shí)驗(yàn)室將使用配備12 V白熾鎢鹵燈（100 W）的顯微鏡設(shè)置為9 V，色溫約為3200 K.雖然這是一種廉價(jià)而有效的設(shè)置，但LED光源正成為主要顯微鏡制造商的默認(rèn)透射光源。LED具有與日光濾光器類似的顯色指數(shù)，可提供出色的靈活性并集成到硬件和軟件中。
LED照明已經(jīng)成為明場(chǎng)顯微鏡的一種選擇，但它在熒光顯微鏡領(lǐng)域卻是如此
已經(jīng)產(chǎn)生了最大的影響。直到最近十年，高壓汞蒸氣電弧放電燈才是氙氣標(biāo)準(zhǔn)配置工作的替代品。大約在這個(gè)時(shí)候，LED成為熒光顯微鏡的一個(gè)選擇。LED克服了很多
與弧光燈相關(guān)的問(wèn)題，包括燈泡的重復(fù)更換和隨后的對(duì)準(zhǔn)，重啟時(shí)間，啟動(dòng)后強(qiáng)度的波動(dòng)以及隨時(shí)間的強(qiáng)度下降。
克服汞和氙系統(tǒng)失效的能力并非如此
最初由LED制造商實(shí)現(xiàn)。對(duì)于需要單色或雙色系統(tǒng)的研究人員而言，LED立即適用。然而，主流市場(chǎng)需要的是適合標(biāo)準(zhǔn)范圍的熒光團(tuán)（DAPI，FITC，TRITC，Cy5）的光源，以及使用Cy5.5，Cy7，CFP，YFP等的靈活性。終端LED系統(tǒng)有四個(gè)“固定”通道，確實(shí)找到了自己的位置，但沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果。
一般光源的作用由金屬鹵化物光源填充。鹵化物燈泡持續(xù)了2000小時(shí)，重要的是它們比四通道LED裝置提供更大的靈活性。鹵化物源也有一些缺點(diǎn)。燈泡在顯微鏡開啟的持續(xù)時(shí)間內(nèi)點(diǎn)亮，而LED僅在短暫的采集期間點(diǎn)亮。一些鹵化物光源的波動(dòng)系數(shù)可以達(dá)到10%。

圖2a，2b。與汞或鹵化物光源相比，基于LED的光源的強(qiáng)度具有更好的壽命和強(qiáng)度穩(wěn)定性（a）。光譜范圍涵蓋大多數(shù)技術(shù)中使用的大多數(shù)熒光團(tuán)的峰值激發(fā)
鹵化物光源本質(zhì)上將UV和IR投射到光導(dǎo)上。由于UV和IR的降解，鹵化物系統(tǒng)中的光導(dǎo)管需要在一段時(shí)間后更換。但LED對(duì)光導(dǎo)的危害較小，消除了任何退化。
為了產(chǎn)生影響，LED制造商需要一種能夠在365到700納米及更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)提供光譜照射的系統(tǒng)。通過(guò)組合多個(gè)波長(zhǎng)生產(chǎn)有效的白光源，可直接替代用戶現(xiàn)有的顯微鏡系統(tǒng)和濾光片立方體。這些還提供了額外的優(yōu)勢(shì)
0到100％的強(qiáng)度調(diào)整，隨時(shí)間穩(wěn)定的強(qiáng)度（圖2a和2b），即時(shí)開/關(guān)和集成到軟件中的機(jī)會(huì)。
白光LED照明系統(tǒng)應(yīng)被視為金屬鹵化物和汞的經(jīng)濟(jì)有效替代品。
如上所述，主要制造商最初為更高級(jí)的例程構(gòu)建了四色LED光源，包括多色，延時(shí)成像。與傳統(tǒng)光源相比，它們具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如強(qiáng)度穩(wěn)定性和速度。
在帶有內(nèi)部快門的標(biāo)準(zhǔn)延時(shí)顯微鏡系統(tǒng)中，快門將被打開，相機(jī)曝光被接合，然后每張照片的快門關(guān)閉。這仍然會(huì)使樣品暴露在來(lái)自弧光燈的光下，使相機(jī)獲取時(shí)間增加一倍，并可能導(dǎo)致光毒性和實(shí)驗(yàn)失敗。
在實(shí)驗(yàn)中，始終建議從樣本中的多個(gè)站點(diǎn)拍攝圖像。這確保了圖像作為整體代表樣本。在某些情況下，很難訪問(wèn)統(tǒng)計(jì)所需的點(diǎn)數(shù)
實(shí)驗(yàn)方案中循環(huán)時(shí)間內(nèi)的顯著性。即使在簡(jiǎn)單的情況下，研究人員使用電動(dòng)顯微鏡并自動(dòng)更換旋轉(zhuǎn)木馬中的過(guò)濾器，顏色之間的切換時(shí)間可以在500到800毫秒之間，慢快門時(shí)間為200毫秒。為克服這一缺陷，一些顯微鏡制造商采用先進(jìn)的弧光照明系統(tǒng)
快速內(nèi)部快門（1 ms），以及相鄰位置之間50 ms延遲的快速濾光輪和衰減器。但是，連續(xù)激活這些組件仍會(huì)增加時(shí)間開銷并導(dǎo)致圖像捕獲速度變慢。為了加快成像速度，一些公司采用實(shí)時(shí)控制器來(lái)并行更換組件;這些系統(tǒng)增加的復(fù)雜性和成本使它們超出了標(biāo)準(zhǔn)研究實(shí)驗(yàn)室的范圍。最初的四通道LED單元獲得了成功
發(fā)光二極管

平面是幾微米，使得這樣小的焦平面易受焦點(diǎn)漂移的影響，這通常是由熱膨脹和收縮引起的。
為了克服熱漂移的挑戰(zhàn)，有兩種常見的方法：基于軟件的算法和基于硬件的z校正。只要細(xì)胞被限制在相似的圖像平面，軟件程序就可以充分地保持焦點(diǎn)，但是可以被自由浮動(dòng)的非粘附細(xì)胞混淆。在硬件漂移校正系統(tǒng)中，光沿物鏡向后反射到檢測(cè)器，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并傳遞到顯微鏡Z驅(qū)動(dòng)器中。無(wú)論細(xì)胞環(huán)境如何，這都將保持所需的焦點(diǎn)位置，并且對(duì)于諸如粘著斑形成或新的超分辨率技術(shù)（即PALM，STORM和GSD）的許多研究項(xiàng)目而言是至關(guān)重要的。

使用LED照明的先進(jìn)技術(shù)
有一系列新興技術(shù)傳統(tǒng)上采用激光照射樣品，但現(xiàn)在轉(zhuǎn)向LED。一個(gè)例子是結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（SIM），一種寬視場(chǎng)技術(shù)，可以將衍射極限以外的橫向分辨率提高一倍。這是通過(guò)將一系列圖案順序投影到樣品上并捕獲圖像，然后進(jìn)行后處理來(lái)實(shí)現(xiàn)的。用于產(chǎn)生圖案的快速LED顏色切換和DMD（可變形鏡裝置）意味著與傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)化圖案生成的機(jī)械方法相比可以實(shí)現(xiàn)高速。
直到最近，旋轉(zhuǎn)盤共焦顯微鏡系統(tǒng)的特點(diǎn)是激光器

在這些情況下取得了一些成功
沒(méi)有必要將硬件快門，衰減器輪或?yàn)V光輪用于配備多波段二向色鏡的顯微鏡。單個(gè)LED可以通過(guò)TTL觸發(fā)在<1 ms內(nèi)以所需強(qiáng)度打開，從而顯著提高速度。
例如，當(dāng)在裝有弧光燈的電動(dòng)顯微鏡中以50ms的相機(jī)曝光時(shí)間成像三種顏色時(shí)，每個(gè)位置的時(shí)間是
2到3秒，取決于組件的速度。對(duì)于配備多波段二向色的LED和顯微鏡，循環(huán)時(shí)間為151 ms。雖然高速系統(tǒng)速度更快，但LED可以顯著超越它們。吸收的主要障礙是四線系統(tǒng)的相對(duì)不靈活性。現(xiàn)在，最新一代LED系統(tǒng)克服了這些問(wèn)題，因?yàn)樗鼈兣鋫淞硕噙_(dá)16個(gè)波長(zhǎng)（圖3a和3b），跨越365nm到770nm，能夠觸發(fā)適合市場(chǎng)上主要四頻濾波器立方體的LED組合。
它們現(xiàn)在已成為普通高速，延時(shí)成像以及下面提到的一些先進(jìn)技術(shù)的照明系統(tǒng)。

焦點(diǎn)漂移校正
LED不僅用于在延時(shí)顯微鏡中照射樣品。它們也用于大多數(shù)焦點(diǎn)漂移校正系統(tǒng)（來(lái)自制造商等）
如徠卡，尼康和蔡司），這是用于保持焦點(diǎn)的反饋設(shè)備。
在高倍率下，焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)
由于通過(guò)系統(tǒng)的光損失而發(fā)光。然而，現(xiàn)在LED更強(qiáng)大，它們被用在一些較便宜的系統(tǒng)中。
對(duì)于允許更多光傳輸?shù)墓獗P，LED特別成功。LED已成為更便宜的替代方案的其他方法是TIRF顯微鏡，光動(dòng)力療法（其中光用于減少腫瘤），FRET（福斯特共振能量轉(zhuǎn)移）用于確定蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用和鈣成像。與最快的基于短弧光柵的系統(tǒng)相比，用于鈣成像的LED已經(jīng)變得普遍，因?yàn)槠鋪喓撩腴_關(guān)和更高的穩(wěn)定性。以前，比例圖像可以10 fps成像。LED的速度增加到100 fps。

光遺傳學(xué)
在神經(jīng)科學(xué)中，長(zhǎng)期以來(lái)一直希望選擇性地靶向一種細(xì)胞類型進(jìn)行研究而不影響樣品中的其他細(xì)胞（圖4）。部分地，這是在15年前通過(guò)使用Cre-Lox方法標(biāo)記細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)已知對(duì)該細(xì)胞類型具有選擇性的基因（圖5）。然而，即使可以標(biāo)記細(xì)胞類型，從單個(gè)細(xì)胞記錄的方法在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性或可能對(duì)組織有害，因此并不總是合適的。
隨著2005年光遺傳學(xué)的發(fā)展，克服了其中一些挑戰(zhàn)。光遺傳學(xué)將動(dòng)作電位的光學(xué)調(diào)制與選擇性靶標(biāo)的遺傳方法結(jié)合起來(lái)。
在異質(zhì)群體中的單細(xì)胞類型，例如在腦組織中。它基于細(xì)菌視蛋白的修飾，細(xì)胞視蛋白是單個(gè)單元，光活化離子泵，其通過(guò)病毒載體選擇性地遞送到靶細(xì)胞中。根據(jù)所表達(dá)的離子通道，將聚焦光照射到細(xì)胞上將選擇性地激活或抑制。
直到過(guò)去幾年，激光仍然被認(rèn)為是光學(xué)刺激，因?yàn)樗鼈兊墓庾V線寬窄，組織中的分散度低于非相干光源。然而，LED的FWHM較窄，最近功率/光輸出增加（光纖末端100 mW / mm2，近似LED總功率的1％和LED的快速時(shí)間切換，“就光遺傳學(xué)應(yīng)用而言，LED在幾乎所有方面都超過(guò)了激光器，”O(jiān)penOptogenet-ics表示（http://openoptogenetics.org/). 隨著光遺傳學(xué)協(xié)議變得更加標(biāo)準(zhǔn)化，并且在新研究實(shí)驗(yàn)室的能力范圍內(nèi)，LED光源也是如此對(duì)研究組來(lái)說(shuō)越來(lái)越有吸引力的選擇。
LED始終具有需要一個(gè)或兩個(gè)波長(zhǎng)的位置，其中不需要超過(guò)四種顏色的靈活性，或者速度是關(guān)鍵因素。然而，隨著最近推出全光譜照明裝置和更先進(jìn)的系統(tǒng)，具有多達(dá)16個(gè)波長(zhǎng)和快速觸發(fā)，LED照明已成為新的標(biāo)準(zhǔn)。

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