細胞遷移在許多復雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測定是研究體外細胞遷移的簡單方法。該測定基于以下觀察：當在匯合細胞單層上產生人工間隙時，所產生的間隙邊緣上的細胞將遷移直至建立新的細胞。ibidi Culture-Insert 系列為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需要幾個步驟。

本應用簡報是使用 ibidiCulture-Insert 2 Well 分析 MCF-7 細胞遷移行為的詳細方案。

圖 1   使用 ibidi Culture-Insert 2 Well 進行傷口愈合測定的實驗工作流程

ibidi Culture-Insert 2 Well 放置在細胞培養(yǎng)表面上，提供兩個細胞培養(yǎng)容器，每個容器由 500μm 壁隔開。在兩個儲庫中填充細胞懸浮液僅允許細胞在指定區(qū)域生長。移除培養(yǎng)插入物 2 在適當?shù)募毎街?，產生大約 500μm 的無細胞間隙。顯微鏡用于評估傷口愈合過程。根據(jù)您感興趣的焦點，可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時間點觀察圖像來完成。測量細胞覆蓋區(qū)域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細胞遷移特征。

實驗工作流程也可以應用于 Culture-Insert 3 Well 和 Culture-Insert 4 Well。他們的區(qū)別是更多的孔和相應的更高數(shù)量的無細胞間隙。

1.  材料

• 細胞：                              MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ:ACC115)
• 同一實驗軟件:                   2 孔插件放在 35 毫米的培養(yǎng)皿中，高壁（ibidi，80206）
• 細胞培養(yǎng)表面：                 ibidi ibitreat
• 細胞培養(yǎng)基：                    RPMI (西格瑪，R8758) = 10% FCS (西格瑪,  F0804)
• 細胞解離溶液：                 胰蛋白酶-ETDA（Sigma，59418C）
• 無菌鑷子
• 倒置顯微鏡，最好具有自動圖像采集系統(tǒng)和用于活細胞成像的階段頂部培養(yǎng)箱

實驗工作流程
步驟 1：細胞接種

為了建立可靠的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，您必須在開始實驗之前定義實驗參數(shù)。這包括例如選擇正確的細胞接種密度。我們建議使用 24 小時后產生 100％ 光學匯合細胞層的密度。

1. 像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細胞和細胞碎片。將細胞懸液調節(jié)至合適細胞濃度。在 24 小時后獲得 3×105 細胞/ ml以獲得匯合的細胞層。

2. 將 70μl 細胞懸浮液應用于 Culture-Insert2 孔的每個孔中。避免搖動 μ-Dish，因為這會導致細胞分布不均勻。

3. 將細胞在 37°C 和 5％CO2 下孵育至少 24 小時

圖 2   在 ibidi Culture-Insert 2 Well 中接種細胞

第 2 步：間隙形成

匯合細胞層是開始該測定的先決條件。去除 Culture-Insert 2 孔后加入新鮮培養(yǎng)基。如有必要，補充培養(yǎng)基中的抑制或增強物質，以評估其對細胞遷移行為的影響。

1. 在顯微鏡下 24 小時后檢查細胞密度。如果在 24 小時后沒有達到匯合的細胞層，則將 μ-Dish 再次置于細胞培養(yǎng)箱中 12-24 小時，定期檢查匯合點。

2. 用無菌鑷子輕輕取出 Culture-Insert 2 孔。如圖 3 所示，刪除 Insert 一角

圖 3   使用無菌鑷子去除 ibidi Culture-Insert 2 孔

3. 移除插入后，檢查您的細胞層是否仍附著在 μ-Dish 的表面上。

4. 用無細胞培養(yǎng)基或 PBS 清洗細胞層，去除細胞碎片和非附著細胞。

5. 使用推薦體積為 2 ml 的無細胞培養(yǎng)基填充 μ-Dish

圖 4   由 ibidi Culture-Insert 2 Well 創(chuàng)建的無細胞間隙

第 3 步：獲取顯微鏡圖片

我們建議錄制延時視頻，以確定時間依賴性和細胞遷移的特征。

1. 將培養(yǎng)皿放在顯微鏡上并移動它直到你有間隙，并在圖像中捕獲兩個細胞前端。使用 4x / 5x 或 10x 物鏡。傷口區(qū)域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

2. 在接下來的幾個小時內多次拍攝圖像，開始觀察過程。

3. 在 ibiTreat 表面上培養(yǎng)的 MCF-7 細胞的時間推移測量進行 20 小時，時間間隔為 30 分鐘。

圖 5   使用 MCF-7 細胞的遷移測定的時間流逝測量（比例尺：200μm）

步驟 4：使用 ACAS 和數(shù)據(jù)解釋進行定量圖像分析

必須分析顯微照片以獲得關于培養(yǎng)細胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動完成，也可以使用自動圖像分析完成自動細胞分析系統(tǒng)（ACAS）由 ibidi 提供。

使用 ACAS 分析此處顯示的示例數(shù)據(jù)。自動圖像分析檢測細胞覆蓋區(qū)域。相對于時間繪制細胞覆蓋區(qū)域顯示了間隙閉合的過程。線性相可用于表征遷移（=傷口閉合的速度）。

線性相的斜率顯示平均刮擦閉合速度為 0.0184×106μm2/ 小時（= 0.44×106μm2/ 天）。

圖 6   ACAS 傷口愈合實驗的定量圖像分析