類器官、細胞球與3D細胞培養(yǎng)在疾病模型與再生醫(yī)學(xué)研究中展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。然而，手動統(tǒng)計仍然是大多數(shù)實驗室進行3D細胞研究時所采用的常規(guī)手段，這種方法不僅耗費大量時間與人力，在統(tǒng)計3D結(jié)構(gòu)尺寸時也容易受到人為因素干擾而造成誤差。本期的小C講堂，將為大家?guī)鞢orning細胞計數(shù)儀(Corning Cat. No. 6749)與類器官計數(shù)軟件(Corning Cat. No. 6749-OC)自動化計數(shù)解決方案，可以快速精準地獲取3D細胞球的數(shù)量與尺寸數(shù)據(jù)。

細胞球的建立

MRC5細胞在康寧 Elplasia? 球面底6孔板（Corning Cat. No. 4440）中培養(yǎng)成球。培養(yǎng)板底部有多個超低吸附表面的微腔，支持每孔形成多達2885個尺寸一致的細胞球。在本研究中我們設(shè)置了3組細胞濃度，使每個微腔中MRC5細胞的起始平均分布各有50、100和200個（每孔起始細胞數(shù)分別為1.44 x 106、2.89 x 106或 5.77 x 106個）用于形成不同尺寸（定義為小、中和大）的細胞球。如圖1所示，細胞接種后在37°C 和 5% CO2 條件下培養(yǎng)2天，即可在微腔中形成細胞球。

圖1. 經(jīng)過兩天的培養(yǎng)后，康寧 Elplasia? 板中形成的尺寸一致的細胞球

細胞球計數(shù)

細胞球懸液制備：將兩個孔中獲得的細胞球（約5000個）轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中，以 200 x g 離心 3 分鐘，棄掉上清并用 100 μL 的 PBS重懸。

Corning細胞計數(shù)儀（Corning Cat. No. 6749）與類器官計數(shù)軟件（Corning Cat. No. 6749-OC）一起用于自動計算球體的濃度和大小。將20 μL 細胞球懸液加入到3D counting chamber (Corning Cat. No. 480201)中，置于載物臺上進行分析。3D counting chamber深度為0.2 mm，適配直徑20– 200 μm的細胞球體結(jié)構(gòu)。康寧自動化解決方案為用戶提供了兩種基于圖像算法的操作選項，以分別應(yīng)對不規(guī)則的3D結(jié)構(gòu)和規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，此處示例為球形結(jié)構(gòu)圖像計算方案。

手動統(tǒng)計是將 10 μL細胞球懸液加入 384 孔高內(nèi)涵成像微孔板（Corning Cat. No. 4681）中，在顯微鏡下仔細觀察、計數(shù)，并計算細胞球濃度。

實驗結(jié)果

Corning細胞計數(shù)儀的圖像分析算法能夠準確識別不同尺寸的細胞球（圖2）。

圖2. 使用Corning細胞計數(shù)儀自動計數(shù)與手動計數(shù)的典型圖。（A-C）每個微腔50個細胞形成的細胞球；（D-F）每個微腔100個細胞形成的細胞球；（G-I）每個微腔200個細胞形成的細胞球；（A, D, G）計數(shù)前細胞球的明場圖像；（B, E, H）使用圖像分析算法分析細胞球的明場圖像；（C, F, I）顯微鏡下 384 孔微孔板中細胞球的明場圖像

相較于手動計數(shù)法，Corning細胞計數(shù)儀計算得出的細胞球濃度更加接近于理論值（圖3），而兩種方法測量出的細胞球的直徑?jīng)]有顯著差異（圖4）。

圖3. 細胞球濃度統(tǒng)計結(jié)果

圖4. 細胞球直徑統(tǒng)計結(jié)果

結(jié)論

Corning細胞計數(shù)儀類器官計數(shù)軟件可以快速且精準地統(tǒng)計類器官或細胞球等3D結(jié)構(gòu)的數(shù)量與尺寸，可以完美代替?zhèn)鹘y(tǒng)的手工計數(shù)方法，既省時省力，又節(jié)約實驗耗材。

Corning細胞計數(shù)儀類器官計數(shù)軟件所提供的圖像分析方法，能在應(yīng)用范圍內(nèi)準確識別出不同尺寸的不規(guī)則類器官或規(guī)則的細胞球，從而為使用者直接提供類器官的數(shù)據(jù)。